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eine Bodenprobe (ca. 200 g)
eine Wasserprobe (oder Schlammprobe) aus einem stehenden Gewässer
Streichhölzer oder Feuerzeug

15 Petrischalen mit Agar (Stärkeagar), hergestellt nach folgender Vorschrift:

Agar 15 g, Stärke 10 g , Pepton 8 g, NaCl 5 g mit H₂O auf 1000 ml aufgefüllt. Die Platten sind gekennzeichnet durch einen blauen Strich auf dem Boden der Platte (warum nicht auf dem Deckel ?)

8 Petrischalen mit Gelatineagar

Agar 15 g, Gelatine 4 g, Pepton 8 g, mit H₂O auf 1000 ml aufgefüllt. Kennzeichnung: roter Strich

2 leere Petrischalen
Impföse (Platinöse)
Glasbügel
große Reagenzgläser
Reagenzglasgestell
kleine (sterile) Zentrifugengläser (mit Alu- Kappe verschlossen) im Reagenzglasgestell
Pipetten : sterilisiert in Pipettenbüchsen

20 á 0,1 ml
20 á 1,0 ml
20 á 10 ml

Laborgasbrenner
3 Bechergläser (1000 ml)
Standzylinder
10 ml Gelatine 1 g / ml
10 ml CaSO₄ (Gips) 1g / ml
Suspension von Bacillus subtilis
Suspension von Escherichia coli
Steriles Wasser
Parafilm
2 Stück Kunststoffolie
3 sterile 100 ml Erlenmeyer
Jod - Jodkaliumlösung
Bleiacetatlösung

15 g Bleiacetat und 10 ml 1 n HCl; mit H₂O auf 100 ml auffüllen

verschimmeltes Brot

Brutschränke , eingestellt auf 37° C
Beleuchtungsvorrichtung (= Bürolampe)
Wasserbäder, eingestellt auf ca. 95°C
Stutzen mit Wasser gefüllt zur Ablage benutzer Pipetten

Wir haben am vergangenen Nachmittag der Einfachheit halber einen "reinen" Bakterienstamm aus dem Labor benutzt. Daran wollen wir heute z.T. noch festhalten; darüberhinaus sollten Sie jedoch Bakterien aus einer Bodenprobe isolieren und zum Wachsen bringen.

Sie sollen daran erkennen, daß es verschiedene Arten gibt, die sich bereits durch die Morphologie der Kolonien voneinander unterscheiden (Größe, Farbe). Im Boden findet man nicht nur Bakterien, sondern auch Pilzsporen, die auf dem Agar ebenfalls auskeimen, und da sie schneller wachsen, alles andere überwachsen können. Die Platten dürfen deshalb nicht zu lange bebrütet.werden (24 - 36 h), anschließend müssen sie im Kühlschrank aufgehoben werden.

Manche Pilze und Bakterien produzieren Antibiotika, die sie ins Medium, den Agar, abgeben; als Folge davon bildet sich ein Hemmhof um den Produzenten herum, in dem nichts anderes wachsen kann. Wenn Sie Glück haben, finden Sie einen derartigen Produzenten. Während der Vorbereitung der Versuche ist uns das einmal gelungen.

Damit Sie aber auf jeden Fall die Wirkung eines Antibiotikums einmal gesehen haben, erhalten Sie von uns etwas verschimmeltes Brot. (Brotschimmel Penicillium notatum). Untersuchen Sie die Wachstumshemmung von Bakterien auf einer Platte, die Sie mit Bodenbakterien beimpfen, und auf die Sie einige Krümel des verschimmelten Brotes verstreut haben.

Das häufigste Bodenbaktenum ist Bacillus subtilis. Bacillus subtilis kann in Form hitzestabiler Sporen vorliegen. Um das zu testen, kochen wir unsere Erdprobe für 15 min. (in einem Wasserbad und plattieren anschließend nochmals aus). Bestimmen Sie das Verhältnis hitzeresistenter zu hitzelabiler Keime. Der Agar, den Sie heute erhalten, unterscheidet sich in einem Punkt von dem, mit dem Sie in der vorigen Woche gearbeitet haben. Die Platten enthalten, außer den üblichen Bestandteilen, Stärke (oder Gelatine). Wir wollen damit testen, ob und wieviele der auskeimenden Bakterien Stärke (bzw. Gelatine = ein Eiweiß) abbauen können. Bacillus subtilis z. B. scheidet ein Enzym, eine Amylase aus, welche Stärke zu Glucose hydrolysiert. Der Nachweis von Amylaseproduzenten gelingt einfach, indem wir die Platten am folgenden Praktikumsnachmittag mit einer Jod - Jodkahumlösung entwickeln. Die Platten müssten blau werden, bis auf Höfe um die Amylaseproduzenten herum.

Jetzt können Sie wieder das Verhältnis der Amylaseproduzenten zu Nichtproduzenten errechnen. Da das Medium ja auch Pepton enthält, ist alles an Nährgtoffen vorhanden, damit auch solche Bakterien wachsen können, die mit der Stärke nichts anfangen können.

Übrigens: auch Speichel enthält Amylase. Wie würden Sie das testen?

Analog zu diesem Versuchsansatz untersuchen wir, welche der Bakterien Proteine abbauen können. Dazu beimpfen wir einige gelatinehaltige Platten. Die Entwicklung erfolgt durch ein Schwermetallsalz (z. B. Bleiacetat). Proteine werden damit unspezifisch gefällt. Wir sollten somit klare Höfe um solche Kolonien herum erhalten, welche ein eiweißabbauendes (= proteolytisches) Enzym ausscheiden.

Enzyme sind Makromoleküle. Die Stoffe, die ein Bakterium zum Wachsen braucht und der Agarplatte entzieht, sind kleine Moleküle. Salze, Glucose, Aminosäuren und Vitamine - letztere sind im Pepton enthalten. Zwischen Makromolekülen und den kleinen Molekülen läßt sich unterscheiden, da letztere eine Folie (z. B. eine Celluphanfolie) passieren können; während Makromoleküle das nicht können. Diese Tatsache erlaubt es uns nun, zwischen Amylase - Ausscheidung und Wachstum der Bakterien zu unterscheiden. Wir bedecken die Hälfte einer Agarplatte mit einer feuchten (aber nicht zu nassen) Folie und beimpfen einmal die Folie und zum anderen den Agar direkt. In beiden Fällen sollten wir ein Wachstum erwarten, aber nur an der unbedeckten Stelle einen Stärkeabbau.

Escherichia coli scheidet keine Amylase aus. Die Unterschiede zwischen diesen beiden Arten lassen sich durch die skizzierten Experimente gut sichtbar machen.

Für alles brauchen wir natürlich noch eine Kontrolle. Wir müssen ausschließen, daß die Bakterien auf der angefeuchteten Folie allein wachsen können; dazu nehmen wir eine der beiden leeren Platten, legen eine angefeuchtete Folie hinein und beimpfen diese. Die übrigbleibenden Platten können Sie nach Belieben infizieren: durch Offenstehenlassen, durch Anhauchen, durch Fingerabdrücke, mit dem Inhalt Ihres Portemonnais etc.

Zum Schluß des Nachmittags setzen wir noch eine WINOGRADSKY- Säule an, um anaerobe Bakterien des mitgebrachten Schlamms bzw. des stehenden Wassers nachzuweisen. Eine WINOGRADSKY- Säule besteht aus einem normalen Standzylinder (oder Meßzylinder - aber letzterer ist teurer), den man bis zu 1 / 6 - 1 / 5 der Höhe mit Erde füllt. Die Erde tränkt man mit der Wasserprobe und gibt 4 ml der Gelatinelösung und 4 ml der CaSO₄ - Lösung hinzu. Die Gelatinelösung dient als zusätzliches Nährsubstrat; CaSO₄ kann durch anaerobe Bakterien zu H₂S reduziert werden, ist also ebenfalls als Substrat anzusehen. Die derart vorbereitete Säule füllt man mit Wasser auf, verschließt sie mit dem Deckel einer Petrischale, stellt sie (mit Gruppennummer beschriftet) ans Licht und wartet bis zum Semesterende, was darin geschieht. Protokollieren Sie jede Woche Ihre Beobachtungen.

Wir haben es hier mit einem genau definierten, geschlossenen Lebensraum zu tun. Der Inhalt des unteren Endes der Säule ist extrem sauerstoffarm, aber H₂S-reich. Es werden sich dort nur Anaerbier entwickeln können. Einige der Anaerobier (z. B. die Rhodospirillen) können eine Photosynthese durchführen. Um sie zu induzieren, belichten wir unsere Proben. Eine Rhodospirillenpopulation ist durch eine starke Rotfärbung erkennbar. Bakterienpopulationen werden sich nur in den Bereichen der Säule entwickeln, die ihren Ansprüchen gerecht werden, z. B. Anaerobier unten und Aerobier direkt an der Oberfläche. Es wird sich somit ein Gleichgewicht einstellen, welches sich im Laufe der Wochen ändern wird, da ja auch in diesem abgeschlossenen Biotop Abbau- und Aufbauprozesse ablaufen. Sie können diesen Versuch deshalb auch als Beispiel für die Demonstration eines ökologischen Gleichgewichts verstehen.

1. Füllen Sie ca. 10 g - 20 g Erde in den sterilen 100 ml Erlenmeyerkolben, und geben Sie darauf etwa die gleiche Menge sterilen Wassers. Verschließen Sie den Kolben mit Parafilm und schütteln Sie die Suspension ca. 10 min. lang. Lassen Sie die festen Partikel dann absetzen und dekantieren Sie den (trüben) Überstand in eines der sterilen großen Reagenzgläser. (Glas 1). Stellen Sie davon, wie am vorigen Versuchstag Verdünnungen 1 : 10 und 1 : 1000 her und plattieren Sie von den 3 Proben (konz., 1 : 10 und 1 : 1000) je 0,05 ml auf je eine Stärke - und eine Gelatineplatte. Verstreichen Sie die Suspension mit dem Glasspatel und stellen Sie die Ansätze in den Brutschrank.

2. Beimpfen Sie mit der konzentrierten Lösung (Glas 1) eine weitere Stärkeplatte. Legen Sie ein Stück des verschimmelten Brotes in die Mitte, stellen Sie auch diese Probe in den Brutschrank.

3. Der verbliebene Inhalt von Glas 1 (Überstand) wird nun 10 min. lang im Wasserbad gekocht. Nach dem Abkühlen wiederholen Sie die Verdünnungsserie und legen erneut eine Plattenserie an.

4. Setzen Sie, wie in der Einführung beschrieben, eine WINOGRADSKY- Säule an.

5. Sie finden am Arbeitsplatz eine Reinkultur von a) Bacillus subtilis und von b) Escherichia coli. Nehmen Sie das Stück Folie, bedecken Sie damit die Hälfte einer Stärkeplatte. Beimpfen Sie diese Platte, indem Sie mit der Impföse in die Suspension tauchen und die Bakterien als einen kurzen Strich (ca. 5 mm lang) auf den Agar und die Folie aufbringen. Wenn Sie von einer Art zur anderen gehen, müssen Sie den Platindraht zwischendurch ausglühen, um ihn zu sterilisieren. Vergessen Sie Ihre Kontrollen nicht (leere Petrischale mit angefeuchteter Folie).

6. Versuch mit Speichel: Sie brauchen ca. 1 ml (im Reagenzglas sammeln). 0,1 ml davon auf eine Stärkeplatte geben, den Rest kurz aufkochen (10 min. ins Wasserbad stellen), dann ebenfalls 0,1 ml davon auf die gleiche Agarpiatte pipettieren. Platten für 30 min. bei 37 °C inkubieren. Anschließend Jod - Jodkahumlösung hinzugeben.

Was beobachten Sie ?